Aleta caudal del pez cebra como modelo para investigar el papel de los probióticos en la regeneración ósea | Grupo de calentadores de conductos de Shenyang

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 8057 (2022) Citar este artículo

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Los probióticos son microorganismos vivos que confieren varios efectos beneficiosos al huésped, incluida la mejora de la mineralización ósea. Sin embargo, la acción de los probióticos sobre la regeneración ósea no está bien estudiada y, por lo tanto, analizamos varios efectos del tratamiento con probióticos sobre la regeneración de la aleta caudal del pez cebra. El análisis morfológico reveló un aumento del área regenerada con segmentos de lepidotrichia más cortos y más gruesos después del tratamiento con probióticos. El análisis de imágenes por espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier destacó la distribución de grupos fosfato en las aletas regeneradas y el grupo probiótico mostró mayores cantidades de hidroxiapatita bien cristalizada. En el punto medio (5 días después de la amputación) de la regeneración, los probióticos pudieron modular varias etapas de diferenciación de osteoblastos, como lo confirma la regulación positiva de algunos genes marcadores clave como runx2b, sp7, col10a1a, spp1 y bglap, además de suprimir la actividad de los osteoclastos, como se evidencia. de la regulación a la baja de ctsk. Los probióticos también provocaron un ciclo celular mejorado al regular la expresión de genes involucrados en las vías de señalización del ácido retinoico (rarga, cyp26b1) y Wnt/β-catenina (ctnnb1, ccnd1, axin2, sost), y también modularon la homeostasis del fosfato al aumentar los niveles de entpd5a. . Estos hallazgos brindan nuevas perspectivas para el uso de probióticos como tratamiento profiláctico para acelerar la regeneración ósea y mejorar la salud esquelética tanto en la acuicultura como en el campo biomédico.

Los probióticos son microbios beneficiosos que pueden ejercer numerosos beneficios para la salud del huésped, incluidos efectos sobre el metabolismo óseo, como se ha informado en varios modelos animales, como aves de corral y roedores1,2,3. Además, en el modelo del pez cebra, pocos estudios han proporcionado evidencia clara del papel de los probióticos en la aceleración de la esqueletogénesis y la mineralización4,5. La administración de probióticos básicamente modula el microbioma del huésped6, que se ha demostrado que afecta el metabolismo óseo a través de muchas formas posibles, incluida la producción de metabolitos7, vías interactivas hormonales, respuestas osteoinmunológicas8 o mediante la síntesis de vitaminas9. Se sabe que muchas especies de probióticos, como Bacillus subtilis, producen vitaminas con propiedades osteogénicas, como la vitamina K210.

La aleta caudal del pez cebra se ha convertido en un sistema modelo de gran éxito para estudiar los mecanismos básicos de la regeneración de tejidos. En condiciones de laboratorio, tiene varias ventajas de estudio, como el fácil seguimiento de los peces vivos, la accesibilidad de las aletas y la ausencia de efectos perjudiciales importantes que causen amputaciones en los peces11. El pez cebra, como modelo genético para la regeneración ósea, ofrece el valor adicional de traducir los hallazgos a una perspectiva biomedicinal en medicinas regenerativas humanas12,13. Se ha detectado en la aleta en regeneración la expresión de ortólogos para importantes actores moleculares osteogénicos de mamíferos, como la β-catenina, además de los ortólogos para sus objetivos posteriores14,15,16. El pez cebra regenera las aletas caudales amputadas mediante la creación de células blastémicas de linaje restringido17,18. Después de una amputación parcial, la aleta con radios óseos y tejido blando entre rayos se regenera de manera muy robusta mediante el establecimiento de blastema, que son poblaciones de células progenitoras mesenquimales de linaje restringido formadas mediante la desdiferenciación de células maduras del muñón19,20. El conjunto de osteoblastos desdiferenciados en el blastema prolifera, se vuelve a diferenciar exclusivamente en osteoblastos no proliferativos y deposita matriz ósea durante la progresión de la regeneración19. Estos pasos de diferenciación se distinguen por varios marcadores de estadio de osteoblastos, como el factor de transcripción 2b de la familia RUNX (runx2b) para los progenitores de osteoblastos hacia la parte distal del blastema proximal, seguido de osteoblastos positivos al factor de transcripción sp7 (sp7 u osterix) y finalmente gamma-carboxiglutamato óseo ( gla) proteína (bglap u osteocalcina) osteoblastos maduros positivos hasta el extremo proximal21. Se ha descubierto que la reexpresión de sp7 y la disminución de bglap son indicadores de la desdiferenciación de las células en el blastema durante la regeneración22. Se ha identificado que otras vías de señalización, entre ellas RA (ácido retinoico)23 y Wnt/β-catenina24,25, son esenciales para la regeneración de las aletas.

Basado en la evidencia de la literatura, el objetivo del presente estudio fue investigar los efectos potenciales de la administración de probióticos en el proceso de regeneración de la aleta caudal. Los peces fueron sometidos a un tratamiento previo con probióticos durante dos semanas antes de la amputación para favorecer la colonización de bacterias beneficiosas en el intestino de los peces tratados y generar los resultados positivos deseados, como se confirmó previamente con otras especies de probióticos26. Utilizando un enfoque multidisciplinario, que abarca desde el análisis de parámetros morfológicos relacionados con el crecimiento de las aletas hasta la evaluación de la expresión de genes representativos involucrados en la osificación, seguido de la cuantificación de fosfatos y otras macromoléculas, nuestro objetivo fue obtener evidencia sobre el papel de las bacterias probióticas en la regeneración ósea que podría ayudar en el desarrollo de protocolos de medicina regenerativa, así como mejorar las prácticas de acuicultura. En este sentido, en el presente estudio se explora la posible acción probiótica sobre el hueso a través del aumento de la actividad de los osteoblastos o de la disminución de la actividad de los osteoclastos, utilizando genes marcadores específicos de osteoblastos y osteoclastos, como la proteína secretada, ácida, rica en cisteína (sparc u osteonectina). y catepsina K (ctsk), respectivamente27.

Para obtener una confirmación preliminar sobre si el tratamiento probiótico puede influir en el proceso de regeneración, se analizaron algunos parámetros morfométricos de las aletas en regeneración. El rendimiento regenerativo entre los grupos experimentales de control (C) y tratados con probióticos (P) se evaluó 5 días después de la amputación (DPA) y 10 DPA analizando el ancho del rayo de la aleta (RAY), calculado promediando el ancho de la segunda aleta bifurcada. rayo en el lóbulo dorsal en la primera articulación del segmento formado después de la amputación; longitud del segmento (SEG), calculada promediando la longitud del primer segmento formado después de la amputación en el segundo rayo de aleta bifurcado en el lóbulo dorsal; REG/STU, que es la relación entre el área regenerada (REG) y el ancho del tocón (STU), y por último REG/PED, que es la relación entre REG y el ancho del pedúnculo (PED). Se siguió el curso completo de la regeneración tanto para los peces C (n = 7) como para los P (n = 7) todos los días a la misma hora. En la Fig. 1a, se muestran imágenes de aletas C y P representativas del mismo pez rastreado antes de la amputación, después de la amputación y 1, 5 y 10 DPA. Se muestra una imagen representativa de una aleta en regeneración con mediciones REG, STU, RAY, SEG y PED (Fig. 1b). Se modificó una ecuación específica de un estudio anterior para calcular el % de regeneración utilizando las proporciones REG/STU y área amputada inicial/STU28. La ecuación modificada. (1) se presenta a continuación:

(a) Fotografías representativas que muestran las aletas antes de la amputación, después de la amputación y a los 1, 5 y 10 DPA en los grupos control (C) (n = 7) y tratado con probióticos (P) (n = 7) (barra de escala = 2000 µm ); (b) Imagen de una aleta amputada representativa, que muestra el área regenerada (REG, trazo de puntos verdes), el ancho del muñón o el ancho del plano de amputación (STU, línea de puntos roja), el ancho del rayo de la aleta (RAY, línea rosa), la longitud del segmento (SEG, línea amarilla) y el ancho del pedúnculo (PED, línea punteada azul); (c) Análisis estadístico de la tasa de regeneración (expresada como%) entre los grupos C y P calculada a 10 DPA con respecto a la aleta antes de la amputación del mismo pez. (d – g) Varios parámetros morfométricos utilizados para analizar las áreas regeneradas en las aletas C y P (n = 7 por grupo por punto de tiempo) (d) Relación área regenerada (REG)/ancho del pedúnculo (PED); (e) Relación área regenerada (REG)/ancho del tocón (STU); (f) Ancho medio del rayo (RAY) y (g) Longitud media del segmento (SEG). Se utilizó la prueba T para analizar las diferencias entre los grupos. % Los valores se convirtieron a los respectivos valores decimales antes de aplicar la prueba T y la significación estadística se estableció en p <0,05.

Este parámetro fue entre un 8% y un 9% mayor en las aletas P que en el grupo C a los 10 DPA (Fig. 1c).

La relación REG/STU fue significativamente mayor en las aletas P que en las aletas C tanto a los 5 DPA (p = 0,036) como a los 10 DPA (p = 0,036), mientras que no se observó ninguna diferencia significativa entre los grupos para la relación REG/PED a pesar de que mostraba la misma patrón como el de REG / STU (Fig. 1d, e). El ancho del tocón (STU) se utilizó para normalizar la variabilidad entre especímenes que surge debido al tamaño variable y la alineación de las aletas; por lo tanto, REG/STU se considera el mejor estándar para normalizar el área regenerada29. Por lo tanto, la falta de una diferencia significativa para la relación REG/PED entre P y C podría deberse a un aumento no significativo en la PED vinculado a una posible variabilidad entre muestras en el tamaño corporal. Otra observación interesante fue que el grupo P tenía rayos de aleta más gruesos (RAYO medio; Fig. 1f) y segmentos más cortos (SEG medio; Fig. 1g) con respecto a C a los 10 DPA. No se observaron diferencias significativas en el peso corporal y la longitud total entre los peces C y P durante la prueba. Estos resultados sugieren que el tratamiento con P aceleró el proceso de regeneración y que las aletas de P regeneradas más grandes tenían segmentos más cortos pero más gruesos.

FTIRI es una herramienta adecuada para estudiar la composición ósea, en particular el contenido de matriz mineral y orgánica, mediante el cálculo de concentraciones relativas utilizando relaciones de intensidad máxima de varios componentes químicos30. En la Fig. 2a, se presenta una imagen representativa de la aleta que muestra las dos regiones del análisis FTIRI, proximal y distal, en el cuarto rayo bifurcado de la aleta en el lóbulo de la aleta dorsal. En la Fig. 2b, c, el análisis de imágenes hiperespectrales de las aletas amputadas C y P se informa en dos puntos temporales de regeneración, 5 y 10 DPA. Como era de esperar, se observó una distribución no homogénea dentro de las áreas cartografiadas y la distribución de fosfatos coincidía claramente con las estructuras óseas en ambas regiones analizadas. En la actinotricia (ver cuadrado punteado negro en los mapas distales; Fig. 2b, c), se detectó un nivel de fosfato más bajo, lo que indica una menor mineralización de esta zona.

(a) Imagen representativa que muestra las áreas analizadas por FTIRI en el cuarto rayo de aleta bifurcada del lóbulo dorsal de la aleta en regeneración. Las dos regiones analizadas después de la amputación fueron: proximal, correspondiente a la primera bifurcación formada después de la amputación, y distal, correspondiente al último segmento articular que precede a la actinotricia; (byc) Microfotografía representativa (izquierda) e imágenes en falso color (derecha) que denotan la distribución topográfica de los grupos fosfato en las áreas proximal y distal de la aleta regenerada de las aletas C y P (n = 3) en (b) 5 DPA y (c) 10 puntos temporales del DPA. Se utilizó la misma escala de colores (0-3) para todas las imágenes en colores falsos: los colores blanco/rosa claro indican las áreas con la mayor cantidad de fosfatos, rojo/naranja/amarillo indican las áreas con una cantidad intermedia y negro/azul oscuro muestra las zonas con menor cantidad de fosfatos. Los cuadrados de puntos negros indican la región donde se extrajeron los espectros para el análisis de ajuste de curvas; ( d – f ) Composición bioquímica y mineralización ósea evaluadas mediante análisis FTIRI. Los histogramas que representan las relaciones de área de banda (d) A1655/A1024, (e) A1240/A1024 y (f) A1024/A1090 se calculan en las regiones proximal y distal de la aleta en regeneración de C (n = 3) y P (n = 3). aletas a 5 DPA y 10 DPA. Los datos se presentan como media ± DE. Letras diferentes sobre los histogramas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Se utilizan ANOVA de dos factores y la prueba de comparación múltiple de Tukey, y la significación estadística se estableció en p < 0,05.

Para evaluar la composición bioquímica y el grado de mineralización del hueso en las dos regiones analizadas, se calcularon las siguientes relaciones de área de banda: A1655/A1024 (relación entre el área de la banda de proteínas Amida I centrada en 1655 cm-1 y el área de la banda de fosfato centrada en 1024 cm-1 (Fig. 2d); A1240/A1024 (relación entre el área de la banda de colágeno centrada en 1240 cm-1 y el área de la banda de fosfato centrada en 1024 cm-1; Fig. 2e) y A1024/A1090 (relación entre el área de la banda de fosfato centrada en a 1024 cm-1 y 1090 cm-1, atribuibles respectivamente a hidroxiapatitas (HA) bien y mal cristalizadas (Fig. 2f). Las proporciones A1655/A1024 y A1240/A1024 suelen estar relacionadas con la cantidad relativa del componente orgánico (proteínas y colágenos) con respecto al inorgánico/mineral (HA óseo)31. Estas dos proporciones mostraron una disminución en el área proximal respecto a la distal. Además, a los 5 DPA, en la región distal, se encontraron valores más bajos estadísticamente significativos para estas proporciones en el grupo P con respecto al C (p < 0,05), indicativo de una mayor cantidad del componente mineral en las aletas P. Por el contrario, no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa para estas dos proporciones a los 10 DPA entre los grupos C y P en ambas regiones analizadas (p > 0,05) (Fig. 2d, e). La relación A1024/A1090 se refiere a la madurez mineral del hueso, representando la transformación del HA de una forma nanocristalina (representada por el pico a 1090 cm-1) a una estequiométrica bien cristalizada (representada por el pico a 1024 cm-1). 1)32. En la región distal, se encontraron valores más altos estadísticamente significativos en las muestras P tanto a 5 DPA como a 10 DPA con respecto a C. En la región proximal, la proporción se mantuvo igual entre las muestras C y P (p > 0,05) (Fig. 2f) . En conjunto, estos resultados sugieren un aumento del contenido mineral y de la madurez mineral en las aletas regeneradas debido al tratamiento con P.

La regeneración de las aletas es un proceso en el que participan células que van desde preosteoblastos hasta osteoblastos maduros. Por tanto, es fundamental considerar que el tratamiento con probióticos puede actuar de forma diferente en distintos estadios de osteoblastos. En nuestro estudio, los niveles de ARNm de marcadores tempranos e intermedios de diferenciación de osteoblastos como runx2b, sp7 y colágeno 10a1a (col10a1a) aumentaron durante la regeneración a los 5 DPA con respecto a 0 DPA tanto en C como en P. Tanto el ARNm de runx2b como el de col10a1a mostraron un Una expresión significativamente mayor en el grupo P con respecto a C a 5 DPA y col10a1a también se expresó altamente en las aletas P a 0 DPA. El marcador tardío bglap aumentó significativamente tanto en C como en P cuando se acercaba la finalización del proceso de regeneración (10 DPA), pero se observó una diferencia significativa entre C y P particularmente en 5 DPA. La expresión del ARNm del marcador específico de osteoblastos maduros, la fosfoproteína 1 secretada (spp1 u osteopontina), fue significativamente mayor en las aletas tratadas a los 5 DPA (Fig. 3). Los resultados indican que el tratamiento con P puede impulsar el avance de los osteoblastos desde la diferenciación temprana hasta la mineralización de la matriz extracelular.

Los valores de ARNm de runx2b, sp7, col10a1a, bglap y spp1 se normalizaron frente a rplp0 y rpl13 en aletas recolectadas de los grupos C (n = 3) y P (n = 3) a 0, 5 y 10 DPA. Los datos se presentan como media ± DE. Letras diferentes sobre los histogramas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Se utilizan ANOVA de dos factores y la prueba de comparación múltiple de Tukey, y la significación estadística se estableció en p < 0,05.

Estudios anteriores informaron sobre la participación de la señalización de la RA en la proliferación de células blastémicas, un proceso clave en la regeneración de las aletas que también está regulado por la señalización de Wnt/β-catenina33. Además, la esqueletogénesis en el pez cebra requiere un control preciso de los niveles de AR y la actividad de Cyp26b134. A los 5 DPA, la enzima degradadora de RA, codificada por el ARNm del citocromo P450, familia 26, subfamilia b, polipéptido 1 (cyp26b1), fue significativamente mayor en el grupo P y se asoció con una menor expresión del receptor de ácido retinoico gamma-a (rarga). con respecto a C. También se encontró que la expresión del ARNm de Rarga era mayor en las aletas amputadas iniciales (0 DPA) del grupo tratado con P que en C. Se observó un aumento en la expresión de la ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 5a (entpd5a), que participa en la La homeostasis de los fosfatos también se observó de 0 a 5 DPA en los grupos C y P. A los 10 DPA, la expresión del gen entpd5a disminuyó y solo en este momento, su nivel de ARNm en el grupo P fue significativamente mayor con respecto al control (Fig. 4). Los cambios de expresión observados en estos genes indican que el tratamiento con probióticos puede modular la vía de señalización de la AR y también regular la homeostasis del fosfato durante la regeneración.

Los valores de ARNm de rarga, cyp26b1 y entpd5a se normalizaron frente a rplp0 y rpl13 en aletas recolectadas de los grupos C (n = 3) y P (n = 3) a 0, 5 y 10 DPA. Los datos se presentan como media ± DE. Letras diferentes sobre histogramas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Se utilizan ANOVA de dos factores y la prueba de comparación múltiple de Tukey, y la significación estadística se estableció en p < 0,05.

La señalización mediada por Wnt/β-catenina desempeña un papel importante en la proliferación de células de blastema16 y el análisis de la expresión de algunos genes clave implicados en esta vía puede proporcionar información esencial sobre el efecto del tratamiento con probióticos sobre la proliferación y diferenciación temprana de los osteoblastos durante la regeneración de las aletas. La catenina (proteína asociada a cadherina), beta 1 (ctnnb1) fue significativamente mayor en el grupo P tanto en el 5 DPA como en el 10 DPA, mientras que su gen transcripcional universal axin2, que también es un regulador de retroalimentación negativa en la señalización Wnt canónica, fue significativamente mayor. mayor en aletas P a 10 DPA. Sparc, que representa el gen que codifica la proteína sparc, que se sabe que previene la degradación de la β-catenina, también fue significativamente mayor a 5 DPA en ambos grupos con respecto a 0 DPA, pero sin ninguna diferencia significativa entre los grupos C y P. El regulador negativo de la señalización Wnt, la esclerostina (sost) y el gen marcador de osteoclastos ctsk fueron significativamente mayores en C a los 5 DPA, mientras que a los 10 DPA, sost fue mayor en el grupo P que en C. Otro gen diana transcripcional posterior de la β-catenina es ciclina D1 (ccnd1), que también es un marcador de proliferación celular, y su ARNm también estaba regulado positivamente en las aletas P con respecto a C a 5 DPA (Fig. 5). En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que el aumento en la actividad de transcripción de β-catenina impulsa la expresión de varios genes reguladores posteriores que también están involucrados en el proceso de regeneración de las aletas. Por lo tanto, se descubrió que la vía de señalización Wnt/β-catenina estaba modulada por el tratamiento con P, lo que conduce a un ciclo celular mejorado, acelerando así el proceso de regeneración y conduciendo a un aumento del área regenerada, como lo demuestran los resultados morfológicos.

Los valores de ARNm de ctnnb1, axin2, sparc, sost, ctsk y ccnd1 se normalizaron frente a rplp0 y rpl13 en aletas recolectadas de los grupos C (n = 3) y P (n = 3) a 0, 5 y 10 DPA. Los datos se presentan como media ± DE. Letras diferentes sobre histogramas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Se utilizan ANOVA de dos factores y la prueba de comparación múltiple de Tukey, y la significación estadística se estableció en p < 0,05.

Utilizando el modelo establecido de regeneración de aletas de pez cebra, evaluamos la modulación de la regeneración en la aleta caudal de pez cebra mediante tratamiento con probióticos. Dado que los peces tratados mostraron un aumento en el área de aleta regenerada en comparación con el área amputada inicial, pero no cambios en la longitud total, el peso y el ancho del pedúnculo, el aumento en el área regenerada puede vincularse de manera concluyente con el efecto del tratamiento con P sobre la regeneración y no con el crecimiento o crecimiento de los peces. alineación de las aletas. Además, las aletas C volvieron al crecimiento isométrico una vez que se regeneró el área amputada, mientras que las aletas P mantuvieron el patrón de crecimiento alométrico de regeneración incluso después de alcanzar el área amputada original. Esto condujo a un crecimiento significativamente mayor del área de las aletas con segmentos de radios de aleta más cortos pero más gruesos que en C. Estudios anteriores han descrito un crecimiento similar durante la regeneración de las aletas mediante la inhibición de la proteína fosfatasa calcineurina y también mediante un efecto integrado de la inhibición de la calcineurina y la señalización bioeléctrica. como los canales de potasio35,36. Por lo tanto, podemos especular que el tratamiento con P podría desempeñar un papel en la activación de la señalización mencionada anteriormente, causando un retraso en el cambio convencional del crecimiento de las aletas al patrón isométrico.

Anteriormente se informó que el crecimiento de aletas relacionado con la inhibición de la calcineurina también estaba asociado con la promoción de la señalización de la AR35,37 y, por lo tanto, en este estudio, se tomó en consideración una posible modulación de la señalización de la AR por P en las aletas regeneradas. Además, también se sabe que la señalización de la RA afecta la diferenciación y mineralización de los osteoblastos junto con la proliferación34, y esto nos sugirió explorar la señalización de la RA a la luz de que otros genes marcadores de diferenciación de osteoblastos también se vieron afectados por el tratamiento con P (Fig. 3). En las aletas amputadas iniciales (0 DPA) que recibieron los probióticos preacondicionados durante 14 días, curiosamente se observó una regulación positiva en el receptor RA, rarga y col10a1a. De hecho, los efectos positivos de la exposición al P en la vía de la AR se describieron previamente en el pez cebra tratado con probióticos, favoreciendo una mayor calcificación de las vértebras4. Se comprueba la actividad de los probióticos en la regulación de genes que intervienen en la calcificación ósea además de modular el proceso de regeneración. Durante la regeneración, la rarga, que se expresa durante la formación del blastema38, aumentó en las aletas C de acuerdo con la regulación molecular establecida del proceso de regeneración, pero se observó una disminución en las aletas P a los 5 DPA. Teniendo en cuenta que la degradación de la RA mediada por cyp26b1 juega un papel importante en la promoción de la rediferenciación de los preosteoblastos a osteoblastos no proliferativos, lo cual es un requisito esencial para la formación de nuevos huesos23, los niveles más altos de RA en las aletas C con respecto a las P aletas, sugiere la promoción de la proliferación de los preosteoblastos y una menor rediferenciación, mientras que las aletas P se encuentran en una etapa relativamente más avanzada de regeneración que implica rediferenciación. Además, niveles más altos de entpd5a en la aleta P completamente regenerada sugieren una mayor concentración de fosfato, ya que entpd5a es un regulador directo de la homeostasis del fosfato39. Sin embargo, en ambos momentos analizados, los resultados de FTIR muestran que en la zona distal, las aletas de P presentan mayor cantidad de fosfatos en forma de HA cristalizado. Dado que esta parte de la aleta, según la fisiología de la regeneración ósea, es la recién formada, estos resultados nos permiten especular que el tratamiento con P acelera la transformación de los fosfatos de una forma amorfa a una más organizada, impulsando así el proceso de maduración ósea40.

La expresión significativamente mayor de marcadores de etapa de diferenciación de osteoblastos tempranos e intermedios, como runx2b, sp7, ctnnb1 y col10a1a en las aletas P en el punto medio de la regeneración (5 DPA) confirma el papel de los probióticos en la modulación del proceso de regeneración en varias etapas de los osteoblastos. Desdiferenciación y proliferación. Runx2b es un marcador de etapa preosteoblástica, que se expresa en el blastema durante la desdiferenciación de los osteoblastos en las primeras etapas de la regeneración21 y sp7 actúa jerárquicamente aguas abajo de runx2b en la vía de diferenciación. Runx2b también regula la expresión de otros genes marcadores importantes de diversas etapas de diferenciación de osteoblastos como col10a1a, spp1, bglap y, por lo tanto, se considera un regulador clave. Col10a1a, que actúa más abajo de sp7, marca las etapas intermedias de la esqueletogénesis (etapas de deposición de matriz ósea)41. Se expresa en osteoblastos y condrocitos tempranos durante la osificación intramembranosa y pericondral de la espina de pescado42,43,44,45 y nuestros resultados mostraron su fuerte regulación negativa hacia la etapa final de regeneración (10 DPA). La activación secuencial de marcadores tempranos apunta a la misma conclusión de que el tratamiento con P promueve significativamente las etapas tempranas e intermedias de los procesos de diferenciación de osteoblastos después de la amputación de las aletas. En cuanto a la mineralización, se evaluaron genes marcadores establecidos de etapas posteriores de diferenciación de osteoblastos y mineralización de la matriz extracelular, como bglap (osteocalcina) y spp1 (osteopontina), ambos actuando aguas abajo y regulados por sp7 y runx221,22,46. En nuestro estudio, ambos estuvieron regulados positivamente durante el proceso de regeneración con una expresión significativamente mayor en las aletas tratadas a los 5 DPA. Estos resultados están respaldados aún más por los niveles más altos de HA cristalizado que se encuentran en las aletas de P, lo que también proporciona evidencia clara del efecto del P en la etapa de mineralización.

La transcripción de Ctnnb1 (β-catenina) fue significativamente mayor en las aletas de P durante la regeneración, lo que sugiere una activación de la señalización de Wnt/β-catenina por parte de P. A partir de la expresión de dos genes diana posteriores de β-catenina, el marcador de proliferación celular ccnd1 y el regulador negativo de β -catenina de señalización axin2, pudimos observar que el aumento de la señalización de β-catenina a los 5 DPA se suprimió hacia los 10 DPA en ambos grupos. Esto confirma que los niveles medidos de β-catenina están bien relacionados con las diferentes etapas de regeneración, siendo mayores durante la fase proliferativa y menores durante las últimas etapas de diferenciación/maduración. La expresión elevada de sparc a los 5 DPA confirma aún más los informes anteriores sobre la participación de esta vía en la regeneración de las aletas como códigos sparc para una proteína de la matriz que se sabe que aumenta la osteoblastogénesis al mejorar la señalización mediada por β-catenina y prevenir la degradación de β-catenina47 . Anteriormente se descubrió que Sparc estaba enriquecido en 4 DPA regenerados27, lo que concuerda aún más con nuestra observación de una cantidad significativamente mayor de Sparc en 5 DPA, aunque no se observaron diferencias entre los grupos. Además, la mayor expresión de sost en el punto medio de la regeneración es un indicador adicional de la modulación de la señalización de Wnt/β-catenina durante la formación del blastema, ya que se encuentra que la esclerostina se expresa en el blastema durante la regeneración temprana de las aletas en el pez cebra16. En nuestro estudio, P causó la regulación negativa de los niveles de ARNm de sost en las aletas de P y un ensayo previo con larvas de pez cebra también informó sobre la regulación de los niveles de sost mediante el tratamiento con probióticos5. La señalización de Wnt/β-catenina también está implicada en la supresión de la actividad de los osteoclastos48,49 y esta evidencia está fuertemente respaldada por nuestros resultados que muestran la capacidad de P para regular negativamente el gen marcador de osteoclastos ctsk27 durante la regeneración.

Los resultados generales sugieren que el tratamiento con P afecta positivamente el proceso de regeneración de la aleta caudal. A nivel molecular, P afectó principalmente a la regeneración en el punto medio (resumido en la figura complementaria S3) y las principales vías moduladas son la señalización de Wnt/β-catenina y RA. El tratamiento indujo un aumento del área regenerada, afectó la morfología de las aletas y mejoró el contenido de HA bien cristalizado. Además, FTIRI puede proponerse como una herramienta adecuada para investigar el proceso de regeneración. Dado que los probióticos pueden tener sus efectos reguladores de múltiples maneras, en el futuro se podrían realizar estudios que investiguen el modo exacto de acción de los probióticos en la regeneración a nivel celular como seguimiento de estos resultados positivos. Dado que esta mezcla de probióticos contiene importantes productores de vitamina K2, como Bacillus subtilis, y que la vitamina K2 es una clase crucial de vitaminas que se sabe que participa en la regulación positiva del desarrollo óseo50, se pueden realizar más estudios centrados en la capacidad de los probióticos para producir vitamina K2. En resumen, el impacto significativo del tratamiento con probióticos en el proceso de regeneración se reveló utilizando la aleta caudal del pez cebra como modelo. Esta observación podría ser útil en estudios de medicina regenerativa ósea donde los probióticos pueden ser un posible candidato profiláctico para mejorar la salud ósea.

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la ley italiana sobre experimentación con animales y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Università Politecnica delle Marche, Ancona, Italia y por el Ministerio de Salud italiano (Aut. No. 583/2020-PR). . Se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales y el estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices de ARRIVE.

Pez cebra de tipo salvaje (AB) de tres meses de edad con un peso medio de 100 ± 7 mg y una longitud total media de 20 ± 2 mm, mantenido a 28,0 °C, pH 7,0, fotoperiodo 12:12 claro: oscuro, NO2 < 0,01 mg/L y NO3 < 10 mg/L, se recolectaron de la instalación pesquera y se dividieron en un grupo de control (C) (n = 24) y un grupo tratado con probióticos (P) (n = 24). El ensayo se realizó utilizando una mezcla de probióticos comercial, Bactosafe H (Bernaqua), que consta de una mezcla de 5 bacterias diferentes: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans y Lactobacillus acidophilus más la levadura Saccharomyces cerevisiae. Dentro de la mezcla de probióticos, B.subtilis, se sabe que la cepa de nuestro interés produce vitamina K2 o menaquinonas, un grupo de vitaminas proosteogénicas10. Los grupos C y P fueron alimentados con una dieta comercial (Zebrafeed, Sparos, Portugal) al 3% del peso corporal dos veces al día y solo el grupo P recibió un suplemento dietético con probióticos a 106 UFC/ml. Se administró un tratamiento de preacondicionamiento de 14 días con probióticos al grupo P para mejorar la colonización intestinal. Al final del preacondicionamiento, los peces se anestesiaron con 0,1 g/l de MS-222 (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se amputaron las aletas caudales 1 o 2 segmentos anteriores a la bifurcación de la segunda lepidotricia bifurcada29. Las aletas amputadas (0 DPA) se almacenaron a -80 °C para la extracción de ARN. Después de la amputación, cada pez se mantuvo por separado para tener réplicas biológicas a una densidad de 1 pez por 200 ml en recipientes de vidrio llenos con agua del sistema de cría. Los recipientes de vidrio se mantuvieron en un baño de agua equipado con calentadores y piedras difusoras para mantener la temperatura homogénea. Se permitió que los peces se regeneraran a 33,0 (± 1) °C para acelerar la regeneración como se informó anteriormente51. Durante la regeneración, los peces fueron alimentados con la misma cantidad de alimento comercial y se les administró la misma concentración de P, que en los 14 días de preacondicionamiento. Se siguió el proceso de regeneración individual (n = 7 por grupo) tomando imágenes del mismo pez antes de la amputación, después de la amputación y 1, 5 y 10 DPA. Se recolectaron muestras de aleta caudal regeneradas a los 5 DPA, que representan el punto medio de regeneración, y a los 10 DPA como el último punto de regeneración para la extracción de ARN y el análisis FTIRI. Las aletas para la extracción de ARN (n = 9 por grupo por momento) se almacenaron a -80 °C. Para el análisis FTIRI, las aletas (n = 3 por grupo por momento) se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 12 h, se lavaron dos veces con PBS y luego se almacenaron en PBS a + 4 °C.

Las imágenes se tomaron utilizando un estereomicroscopio (Leica, Alemania) antes de la amputación, después de la amputación y a los 1, 5 y 10 DPA para seguir el progreso de la regeneración en las aletas C y P (n = 7 por grupo). Los peces se anestesiaron antes de la obtención de imágenes utilizando MS-222 a 0,6 mM y, después de la obtención de imágenes, los peces pudieron recuperarse en agua dulce con aireación. Se realizaron estudios morfológicos midiendo algunos de los parámetros previamente descritos: REG (área regenerada), PED (ancho del pedúnculo), STU (ancho del muñón), RAY (ancho del radio de la aleta) y SEG (longitud del segmento) y dos relaciones REG/STU y REG/PED29. Las imágenes de las aletas se analizaron utilizando ImageJ (versión 2.1.0/1.53c; Wayne Rasband, Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.) y las macros de ImageJ utilizadas para analizar las imágenes se programaron específicamente para los parámetros de regeneración de la aleta caudal (proporcionados como Datos complementarios S1). .

El análisis FTIRI se realizó mediante un interferómetro Bruker INVENIO acoplado con un microscopio Hyperion 3000 IR-Vis y equipado con un detector FPA (Bruker Optics, Ettlingen, Alemania). Se depositaron muestras de aletas de los grupos experimentales C y P (n = 3 por grupo por momento) en ventanas ópticas de CaF2. Utilizando un objetivo de condensador de 15x, se seleccionaron áreas específicas en cada muestra de aleta. Las dos regiones analizadas después de la amputación en el cuarto radio de la aleta bifurcada del lóbulo de la aleta dorsal se describen como: proximal, correspondiente a la primera bifurcación distal y distal, correspondiente al último segmento articular que precede a la actinotricia (ver Fig. 2a). En estas áreas, los mapas de IR se adquirieron en modo de transmisión en el rango espectral de 4000 a 800 cm-1. Cada mapa tenía un lado de 164 × 164 micrones y fue el resultado de 4096 píxeles/espectros (256 escaneos), con una resolución espacial de 2,56 × 2,56 micrones. Los mapas de IR sin procesar se corrigieron para detectar dióxido de carbono y vapor de agua y luego se normalizaron los vectores en todo el rango espectral (rutinas de compensación atmosférica y normalización de vectores, paquete de software OPUS 7.5). Se obtuvieron imágenes en falso color que representan la distribución topográfica de los grupos fosfato integrando todos los mapas de IR en el rango espectral de 1185–980 cm-1 (asignado a las vibraciones de estiramiento de los grupos fosfato). Se utilizó una escala de colores arbitraria en la que los colores blanco/rosa claro representan las zonas con mayor absorción de fosfatos, mientras que negro/azul oscuro denotan las zonas con menor absorción de fosfatos.

En cada mapa de IR, se extrajo un submapa (aproximadamente 300 espectros/píxel) en correspondencia con el hueso en las dos regiones analizadas. Se calcularon el espectro promedio y el espectro promedio ± desviación estándar, y la curva se ajustó en el rango espectral de 1800 a 900 cm-1. El número y la posición (expresados en números de onda, cm-1) de las bandas subyacentes se identificaron mediante análisis de mínimos de segunda derivada y se fijaron durante el procedimiento con funciones gaussianas (GRAMS/AI 9.1, Galactic Industries, Inc., Salem, New Hampshire). Las áreas integradas (A) de las bandas subyacentes se usaron para calcular las siguientes proporciones de área de banda: A1655/A1024 (proporción de proteína a fosfato), A1240/A1024 (proporción de colágeno a fosfato) y A1024/A1090 (HA bien cristalizado a fosfato deficiente). proporción de HA cristalizado).

Se hicieron grupos de 3 aletas para tener 3 réplicas por grupo para cada punto de tiempo. El ARN total se extrajo de la aleta caudal amputada (0 DPA) y de las aletas caudales regeneradas (5 y 10 DPA) utilizando RNAeasy Microkit (Qiagen, Italia). Luego se eluyó en 20 µl de agua libre de nucleasas de grado molecular. Las concentraciones finales de ARN se determinaron utilizando un nanofotómetro. El ARN total se trató con ADNasa (10 UI a 37 °C durante 10 min, MBI Fermentas). Se usó un microgramo de ARN total para la síntesis de ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Italia) y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior como se describió anteriormente52.

Las qRT-PCR se realizaron en aletas C y P (n = 3 para C y P, en cada punto de tiempo) con SYBR green (Bio-Rad, Milán, Italia) en un termociclador CFX (Bio-Rad, Milán, Italia). ) como se describió anteriormente53. El perfil térmico para todas las reacciones fue de 3 min a 95 °C seguido de 45 ciclos de 20 s a 95 °C, 20 s a 60 °C y 20 s a 72 °C. El análisis de la curva de disociación mostró un único pico en todos los casos. La proteína ribosómica L13 (rpl13) y la proteína ribosómica grande, P0 (rplp0) se utilizaron como genes de mantenimiento para estandarizar los resultados eliminando la variación en la cantidad de ARNm y ADNc. No se observó producto de amplificación en los controles negativos y nunca se observó formación de dímero de cebador. Los datos se analizaron utilizando el sistema óptico iQ5 versión 2.1 (Bio-Rad), incluidos los archivos Genex Macro iQ5 Conversion y Genex Macro iQ5. La modificación de la expresión génica entre los grupos experimentales se informa como abundancia relativa de ARNm (Unidades arbitrarias). Los cebadores se utilizaron a una concentración final de 10 pmol/ml. Todas las secuencias de cebadores utilizadas en el estudio se enumeran en la Tabla complementaria S2.

Se utilizó la prueba T para analizar las diferencias de los parámetros de regeneración morfológica entre los grupos. Se aplicó un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) seguido de las pruebas post hoc de Tukey a los datos de IR y qRT-PCR para comparar las diferencias entre los grupos experimentales. Todas las pruebas se realizaron con R versión 3.6.154 y los gráficos se generaron con ggplot2 3.2.1. La significancia estadística se fijó en p < 0,05 para todas las pruebas.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Descargar referencias

Este trabajo es parte de un proyecto que ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie nº 766347 para OC. Los autores desean agradecer al Dr. Manu Kumar Gundappa por los scripts R y el macros utilizadas en ImageJ.

Departamento de Ciencias de la Vida y el Medio Ambiente, Universidad Politécnica de Las Marcas, Via Brecce Bianche, 60131, Ancona, Italia

Jerry María Sojan, Giorgia Gioacchini, Elisabetta Giorgini, Patrick Orlando, Luca Tiano, Francesca Maradonna y Oliana Carnevali

Instituto Nacional de Bioestructuras y Biosistemas—Consorcio Interuniversitario, Viale delle Medaglie d'Oro 305, 00136, Roma, Italia

Francesca Maradonna y Oliana Carnevali

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OC, JMS y FM concibieron el experimento, JMS, PO y GG realizaron análisis formales, GG, FM y EG validaron los datos, JMS, OC, FM, GG y LT escribieron el texto principal del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Francesca Maradonna o Oliana Carnevali.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sojan, JM, Gioacchini, G., Giorgini, E. et al. Aleta caudal del pez cebra como modelo para investigar el papel de los probióticos en la regeneración ósea. Representante científico 12, 8057 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12138-z

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Recibido: 06 de septiembre de 2021

Aceptado: 25 de abril de 2022

Publicado: 16 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12138-z

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